Die bayerischen Herzöge hatten sich Anfang der 1520er Jahre für den Katholizismus entschieden und auf eine strikte gegenreformatorische Politik verständigt. Dies blieb nicht ohne Folgen für die Universität in Ingolstadt, wo mit Vizekanzler Johannes Eck der theologische Hauptgegner Martin Luthers tätig war. Eck hatte sich früh mit den lutherischen Lehren auseinandergesetzt und dessen Gefahr für die hergebrachte Kirchenordnung erkannt. Auf der Leipziger Disputation 1519 gelang es ihm auch, Luther auf häretische Positionen festzulegen. Den in Rom anlaufenden Prozess gegen Luther unterstützte Eck ein Jahr später persönlich vor Ort. In der „Ewigen Stadt“ arbeitete er an der päpstlichen Bannandrohungsbulle maßgeblich mit und bemühte sich anschließend um deren Veröffentlichung in Deutschland. Dieses Engagement war allerdings nicht ganz frei von persönlichen Motiven.
In Ingolstadt mussten der Theologe Arsacius Seehofer und der Botaniker Leonhard Fuchs aus Glaubensgründen die Universität verlassen. Umgekehrt diente Ingolstadt katholischen „Glaubensflüchtlingen“ als Rückzugsort, so unter anderem dem Engländer Robert Turner, der Regens des Georgianums und 1584/85 Universitätsrektor wurde. Auch die Professoren Vitus Amerbach, Rudolf Clenck, Martin Eisengrein und Friedrich Staphylus kamen, nachdem sie dem reformatorischen Lager angehört hatten, nach Ingolstadt.
Nach dem Tod Ecks im Jahr 1543 befand sich die Universität in einer schwierigen Phase. Die äußeren Umstände waren ungünstig: Die Pest erzwang ein vorübergehendes Exil in Kelheim und der Schmalkaldische Krieg 1546 zerstreute die Universität erneut. Die Theologische Fakultät litt unter Personalmangel, was umso schwerer wog, da die bayerischen Herzöge zur Festigung des alten Glaubens auf eine fundierte Klerikerbildung angewiesen waren.
Herzog Wilhelm IV. nahm daher Verhandlungen mit dem Jesuitenorden auf, um die Entsendung von Theologen nach Ingolstadt zu erreichen. Erstmals wurden an einer deutschen Universität Lehrstühle mit Jesuiten besetzt. Durch deren Lehrtätigkeit in Ingolstadt konnte sich der Jesuitenorden zum herausragenden Lehrorden der Gegenreformation entwickeln. Die Besetzung hatte damit nicht nur für Bayern Konsequenzen: 1648 waren an den 17 der 18 katholischen Universitäten des Reiches jesuitische Professoren tätig.
