22.01.2016
Eine neue Methode, um Proteinmodifikationen zu analysieren: Forscher von LMU und Helmholtz Zentrum kartieren die Phosphorylierungsstellen des Enzyms RNA Polymerase II, das für die Abschrift unserer Gene verantwortlich ist.
Die Inhalte in unserem Erbgut sind eigentlich stumm, also inaktiv, und müssen erst zum „Sprechen“ gebracht werden. Wie der Lesekopf in einem Tonbandgerät fährt die RNA Polymerase II, kurz Pol II, über die DNA und übersetzt die genetische und epigenetische Information in RNA. Damit das Enzym aber nicht wahllos arbeitet, wird es an vielen unterschiedlichen Stellen dynamisch modifiziert, um seine Aktivität situationsbedingt zu steuern.
„An 240 verschiedenen Stellen der Pol II kann durch Phosphorylierung auf die Aktivität des Enzyms Einfluss genommen werden“, sagt Professor Dirk Eick, Letztautor der Studie und Leiter der Abteilung Molekulare Epigenetik am Helmholtz Zentrum München. Gemeinsam mit Professor Axel Imhof und Dr. Tobias Straub, die die Core Facilities für Bioinformatik und Proteinanalytik am Biomedizinischen Centrum der LMU leiten, sowie Kollegen am Genzentrum der LMU und des Max-Planck-Instituts für biophysikalische Chemie in Göttingen wurde nun eine Methode entwickelt, um alle 240 Stellen in der Pol II zeitgleich zu untersuchen. Die Ergebnisse wurden nun im Fachjournal Molecular Cell publiziert.
Jede einzelne Phosphorylierungsstelle untersucht
Die Forscher haben genetische und massenspektrometrische Methoden kombiniert. „Das Anheften einer Phosphatgruppe an ein Protein verändert nicht nur die Funktion der Pol II, sondern auch deren Masse. Diesen Unterschied kann man mit Hilfe der hochauflösenden Massenspektrometrie messen“, erläutert Axel Imhof. Aufgrund der Vielzahl von möglichen Phosphorylierungsstellen im Pol II Enzym war es notwendig, an definierten Stellen künstliche Protease-Schnittstellen einzuführen, um eine genaue Kartierung dieser Stellen zu ermöglichen. „Indem wir genetisch veränderte Varianten der betreffenden Regionen herstellen, können wir jede einzelne Phosphorylierungsstelle untersuchen“, sagt Dr. Roland Schüller vom Helmholtzzentrum. Die massenspektrometrische Analyse führte zu einer enormen Datenmenge. „Sie konnte nur durch den Einsatz von aufwendigen bioinformatischen Methoden interpretiert werden“, sagt Tobias Straub. Die so etablierten Analysemethoden konnten dann auch verwendet werden, um die Pol II-Modifikationsmuster beim Menschen und bei der Hefe zu vergleichen.
„Die Regulation der Transkription von Genen durch Pol II ist ein elementarer Prozess des Lebens und jedwede Abweichungen in der Genregulation sind die Grundlage vieler menschlicher Erkrankungen“, ordnet Studienleiter Eick die Arbeit ein. „Die Erforschung der Phosphorylierungsmuster zu bestimmten Zeitpunkten während des Transkriptionszyklus ist daher eine Voraussetzung, um in Zukunft die grundlegenden Mechanismen der Genregulation auf Transkriptionsebene zu verstehen.“Molecular Cell 2016 (Helmholtz Zentrum/LMU)